Ontogenia de los esporangios y esporogénesis del helecho Phymatosorus scolopendria (Polypodiaceae)

Introducción: Las investigaciones sobre ontogenia de los soros, esporangios, paráfisis receptaculares y esporogénesis de los helechos leptosporangiados son escasas en la literatura científica. Objectivos: Describiry analizar la ontogenia de los soros, esporangios, paráfisis receptaculares y esporogénesis de Phymatosorus scolopendria. Métodos: Entre marzo y mayo 2017 (época lluviosa del año) se recolectaron frondas fértiles de P. scolopendria en el campus de la Universidad de Antioquia, Medellín-Colombia.Las frondas fértiles, en diferentes etapas del desarrollo se fijaron y procesaron de acuerdo a protocolos estándar para la inclusión y corte en parafina y resina. Las secciones de 0.5 µm obtenidas en resina se tiñeron con azul de Toluidina que tiñe diferencialmente paredes primarias y secundarias, resalta núcleos celulares, y esporopolenina y de manera secundaria tiñe polifenoles. Para descripciones detalladas, otros cortes se tiñeron con Safranina-azul de alciano que discrimina entre componentes de pared primaria, secundaria, núcleos, cutícula y polifenoles; Hematoxilina-azul de alciano para resaltar núcleos y paredes primarias y Fluoroglucinol ácido para detectar lignina. Las observaciones y registro fotográfico se efectuaron con microscopio fotónico. Para la observación y descripción con microscopía electrónica de barrido (MEB), los soros se deshidrataron con 2,2 dimetoxipropano, se desecaron a punto crítico y se metalizaron con oro. Resultados: Los soros son exindusiados, superficiales, vascularizados y de desarrollo mixto, se encuentran asociados a paráfisis receptaculares multicelulares uniseriadas. Durante el desarrollo del soro primero se diferencian las células epidérmicas receptaculares que darán origen a los esporangios y posteriormente las células que originarán a las paráfisis receptaculares. El esporangio es de tipo leptosporangio de pedicelos largos de una o dos filas de células. Los anillos de los esporangios muestran paredes secundarias con engrosamientos en forma de "U" ricos en lignina. La meiosis es simultánea y las tétradas de esporas se disponen de forma decusada o tetragonal. El tapete celular es inicialmente uniestratificado pero por una división mitótica de tipo periclinal, se torna biestratificado. Las células del estrato interno del tapete pierden la integridad estructural dando origen a un tapete plasmodial que invade los esporocitos en meiosis, el estrato externo persiste hasta la etapa de esporas maduras. En las diferentes etapas de desarrollo del esporodermo, primero se forma el exosporio, compuesto por esporopolenina, seguida del endosporio, conformado por celulosa, pectina y polisacáridos carboxilados y finalmente el perisporio. Los polifenoles fueron detectados, principalmente, en las vacuolas de las células de los esporangios, paráfisis y células receptaculares. Para el momento de la liberación de las esporas, tanto la capa externa del tapete celular como el plasmodial han degenerado por completo. En la cavidad esporangial se aprecian orbículas adyacentes a las esporas. Conclusiones: la ontogenia de los esporangios y esporogénesis de P. scolopendria es similar al descrito previamente para helechos leptosporangiados. Adicionalmente, se indica que las paráfisis receptaculares presentes en los soros de P. scolopendria tienen la función de protección de los esporangios durante las primeras etapas del desarrollo.

Introduction: Research about the ontogeny of sori, sporangia, receptacular paraphyses and sporogenesis of leptosporangiate ferns are scarce in the scientific literature. Objectives: To describe and analyze the ontogeny of sori, sporangia, receptacular paraphyses and sporogenesis of Phymatosorus scolopendria. Methods: Fertile fronds of P. scolopendria were collected in the campus of the Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia, during the months March and May (annual rain season) of 2017. The fertile fronds of the samples at different developmental stages were fixed and processed according to the standard protocols for embedding and sectioning in paraffin and resin. Sections of 0.5 µm obtained in resin were stained with Toluidine blue, which differentially stains primary and secondary walls, highlights the cell nucleus and sporopolenin and secondarily stains polyphenols. For detailed descriptions, additional sections were processed with Safranin-Alcian blue, allowing the distinction of components of primary and secondary walls, nuclei, cuticle and polyphenols; Hematoxylin-Alcian blue to enhance nuclei and primary walls and Phloroglucinol-HCl for lignin. Observations and photographic records were done with a photonic microscope. For the observations and descriptions with scanning electron microscopy (SEM), the sori were dehydrated with 2,2-dimethoxypropane, critical point dried and coated with gold. Results: The sori are exindusiate, superficial, vascularized and have mixed development; they are associated with uniseriate and multicellular receptacle paraphyses. During the development of the sori, the epidermal cells of the receptacle that will form the sporangia are the first differentiated followed by those forming the receptacle paraphyses. The sporangium is leptosporangiate, with long stalks formed by one or two cell rows. The annulus of the sporangia displays secondary walls with U-shaped thickenings rich in lignin. The meiosis is simultaneous and the spore tetrads are arranged in a decussate or tetragonal shape. The cellular tapetum is initially unistratified but becomes bistratified after a periclinal division. The cells of the internal strata of the cellular tapetum loose structural integrity giving rise to a plasmodial tapetum that invades the meiotic sporocytes. During the sporoderm development, the sporopollenin-composed exospore is the first formed followed by the endospore, composed by cellulose, pectin and carboxylated polysaccharides; the process ends with the perispore. Polyphenols were mainly detected on vacuoles in cells of the sporangium, paraphysis and receptacle. When the time comes for the spore maturation, the remnants of cellular and the plasmodial tapeta have fully degenerated. Abundant orbicles are seen near the spores in the sporangial cavity. Conclusions: The ontogeny of the sporangia and sporogenesis of P. scolopendria are similar to the previously described for leptosporangiate ferns. Furthermore, in P. scolopendria, the receptacle paraphyses of the sori have a role protecting the sporangium during the early development stages.

Alteraciones histopatológicas causadas por la roya Puccinia nakanishikii (Pucciniales: Pucciniaceae) en plantas de Cymbopogon citratus (Poaceae)

Introducción: Los aspectos histopatológicos e histoquímicos relacionados con el ataque de royas en plantas, así como su relación con los diferentes estados espóricos, son escasos en la literatura científica. Objetivos: Describir y analizar los aspectos histopatológicos e histoquímicos en Cymbopogon citratus y su relación con los diferentes estados espóricos de la roya Puccinia nakanishikii. Métodos: Durante abril y agosto 2013 se recolectaron hojas sanas e infectadas con Puccinia nakanishikii en la escarpa noroccidental de la meseta de Bucaramanga-Colombia. Las muestras con lesiones en diferentes etapas del desarrollo se fijaron y procesaron de acuerdo a protocolos estándar para la inclusión y corte en parafina y resina. Las secciones obtenidas en parafina (5-7 µm) fueron teñidas con Safranina-azul de Alcian y azul de Alcian-Hematoxilina. En tanto que las secciones obtenidas en resina (0.5 µm) se tiñeron con azul de Toluidina. También se elaboraron secciones a mano alzada para análisis de autofluorescencia. Las observaciones y registro fotográfico se efectuaron con microscopio fotónico y microscopía de epifluorescencia. Para observaciones con microscopía electrónica de barrido (MEB), las muestras se fijaron en Glutaraldehído, se deshidrataron con 2,2 dimetoxipropano, se desecaron a punto crítico y se metalizaron con oro. Resultados: Las hojas son por lo general hipostomáticas, con células epidérmicas largas y cortas formando filas paralelas y con la presencia de tricomas unicelulares espinosos y microtricomas. La superficie abaxial está cubierta por una densa capa de ceras epicuticulares y la adaxial está formada por agrupaciones de células buliformes y células epidérmicas de contorno rectangular o cuadrado. En el mesófilo no hay diferenciación entre parénquima de empalizada y esponjoso y su anatomía refleja el metabolismo C4 presente en esta gramínea. Se observó la formación de urediosoros y teliosoros hipófilos. Las urediosporas son la fase de reinfección y estas tienen de 4-5 poros germinativos ecuatoriales y su pared es equinulada. Las teliosporas son de pared lisa y de pedicelo persistente. Las urediosporas forman tubos de geminación por lo general sobre la superficie abaxial de la hoja y se desarrollan en dirección de los estomas, por donde penetran al interior del mesófilo. No se observó la presencia de apresorios. La epidermis se desprende y levanta por del desarrollo de las urediosporas y las paráfisis capitadas, a medida que el urediosoro crece. Con el avance de la infección, los tejidos fotosintéticos se desorganizan, pierden la autofluorescencia de la clorofila y las células sufren necrosis. Posteriormente, los tejidos vasculares se fragmentan y colapsan. Para este momento, la infección se ha extendido sobre toda la lámina foliar llevando a la muerte de la hoja y defoliación de la planta. Durante etapas avanzadas de la infección en los urediosoros se observaron picnidios, probablemente del hiperparásito Sphaerellopsis, asociados estrechamente a los tejidos infectados por la roya. Conclusiones: Puccinia nakanishikii se desarrolla sobre las hojas de Cymbopogon citratus produciendo urediosoros y teliosoros. Las urediosporas son la fase de reinfección, y las teliosporas solo se observaron en etapas avanzadas de la infección. La epidermis y los tejidos fotosintéticos son severamente afectados por la necrosis celular. En etapas avanzadas de la infección los tejidos vasculares se ven afectados.

Introduction: Histopathological and histochemical aspects linked to the attack of fungal rusts to plants, as well as its relation with the different spore stages are topics rather scarce in the scientific literature. Objective: To describe and analyze the histopathological and histochemical aspects of Cymbopogon citratus and its relation with the different stages of the spores from the rust fungi Puccinia nakanishikii. Methods: During the months April and August 2013, leaves healthy and infected by Puccinia nakanishikii were collected in the Northwestern scarp of the Bucaramanga-Colombia plateau. The samples with injuries on diverse developmental stages were fixated and processed according to the standard protocols for embedding and sectioning in paraffin and resin. Sections obtained from paraffin (5-7 µm) were stained with Safranin-Alcian blue and Alcian blue-Hematoxylin. On the other hand, sections obtained from resin (0.5 µm) were stained with Toluidine blue. Further, freehand sections were obtained for an autofluorescence analysis. The observations and photographic record were done via photonic microscope and epifluorescence microscope. For the observations via scanning electron microscopy (SEM), the samples were fixated in Glutaraldehyde, dehydrated with 2,2 dimethoxypropane, then desiccated to critical point and finally coated with gold. Results: The leaves are generally hypostomatic, with long and short epidermic cell forming parallel rows and showing unicellular prickle trichomes and micro-trichomes. The abaxial surface is covered by epicuticular wax forming a dense layer. The adaxial epidermis is formed by groupings of bulliform cells and epidermal cells with rectangular or squared contour. In the mesophyll, there is no differentiation between palisade and spongy parenchyma, its anatomy reflects the C4 metabolism. The formation of uredosori and teliosori both hypophyllous was observed. Urediniospores are the reinfecting agents phase, they have 4-5 equatorial germ pores and echinulate wall. Teliospores have smooth wall and a persistent pedicel. The urediniospores form a germ tube, generally on the abaxial leaf surface, these tubes develop towards the stomata reaching the mesophyll interior. No appressorium were observed. The epidermis limiting the uredosorus detaches due the development and pressure that exert both the urediniospores and capitate paraphyses. As the infection progresses, autofluorescense of the chlorophyll is lost and the cells undergo necrotic processes. Afterwards, the phloem collapses and the xylem becomes slightly disorganized. At this moment, the infection is extended along the whole leaf blade, resulting in the leaf death and the plant defoliation. On advanced stages of the infection, the uredosori showed pycnidia, probably belonging to the hyperparasite Sphaerellopsis, these structures were closely associated to the rust infected tissues. Conclusions: Puccinia nakanishikii develops on the leaves of Cymbopogon citratus producing uredosori and teliosori. Urediniospores are the reinfective stage, teliospores were only observed at late stages of the infection. The epidermis and photosynthetic tissue are severely affected by cell necrosis. The vascular tissues are deeply affected on the advances stages of the infection.

Actividad antimicrobiana de hongos endófitos de las plantas medicinales Mammea americana (Calophyllaceae) y Moringa oleifera (Moringaceae) / Antimicrobial activity of endophytic fungi from the medicinal plants Mammea americana (Calophyllaceae) and Moringa oleifera (Moringaceae)

Introducción. Las enfermedades infecciosas son una causa importante de muertes en el mundo. La resistencia antimicrobiana es un problema global, por lo que es conveniente la investigación de nuevas fuentes de agentes antimicrobianos de origen natural potencialmente efectivos. Objetivo. Evaluar la actividad antimicrobiana de hongos endófitos de Mammea americanay Moringa oleifera en la cepa sensible (ATCC 29213) y en la cepa resistente (USb003) de Staphylococcusaureus, así como en la cepa sensible (ATCC 25922) y la cepa resistente (USb007) de Escherichia coli. Materiales ymétodos. Se aislaron 14 hongos endófitos de las hojas, semillas y tallos de las dos plantas en estudio. Se evaluó su actividad antimicrobiana mediante la formación de halos de sensibilidad por ensayo dual in vitro y pruebas con extractos etanólicos crudos provenientes de los endófitos a los que se les evaluó la concentración mínima inhibitoria (CMI), la concentración bactericida mínima (CBM) y la citotoxicidad. Resultados. Tres extractos etanólicos de Penicillium sp., Cladosporium sp. (001) y Cladosporium sp.(002) presentaron mayores halos de inhibición en cepas sensibles y resistentes de E. coli y S. aureus. La CMI y la CBM halladas fueron estadísticamente significativas (p≤0,05), comparadas con el control de gentamicina. Las pruebas de citotoxicidad (concentración citotóxica, CC50>1.000) demostraron que los hongos endófitos poseen características bactericidas y no ocasionan daño alguno. Conclusión. Se halló una fuente de metabolitos secundarios activos con propiedades antimicrobianas y no tóxicas en los hongos endófitos de M. oleifera y M. americana;estos hallazgos son importantes para continuar con la identificación química de los compuestos y el estudio de sus mecanismos de acción en estas plantas en las que el aislamiento de endófitos ha sido escaso.

Introduction: Infectious diseases represent one of the leading causes of death worldwide. Considering the growing global challenge of antimicrobial resistance, research into new sources of potentially effective antimicrobial agents from natural origins is of great importance for world health. Objective: To evaluate the antimicrobial activity of endophytic fungi from Mammea americana and Moringa oleifera upon Staphylococcus aureus (ATCC 29213), S. aureus(resistant strain USb003), Escherichia coli (ATCC 25922), and E. coli (resistant strain USb007). Materials and methods: We isolated endophytic fungi from the leaves, seeds, and stems of the two plants under study. We evaluated their antimicrobial activity through the formation of sensitivity haloes in dual tests in vitro, as well as in trials using crude ethanolic extracts from the endophytes. The minimum inhibitory concentration (MIC), minimum bactericidal concentration (MBC), and cytotoxicity o the substances were analyzed. Results: Three ethanolic extracts of Penicillium sp., Cladosporium (001), and Cladosporium (002) exhibited the greatest inhibition halos in sensitive and resistant strains of E. coli and S. aureus. The MIC and CBM found were statistically significant (p≤0.05) compared with the gentamicin control. Furthermore, the cytotoxicity test results of CC50>1,000 demonstrated that the endophytic fungi studied exhibit bactericidal characteristics without causing unintended damage. Conclusion: The endophytic fungi M. oleifera and M. americana represent a source of active secondary metabolites with antimicrobial and non-toxic properties. In light of these findings, further research should proceed with chemical identification of the compounds and the study of their mechanisms of action, especially given the paucity of current scientific knowledge concerning the isolation of endophytes in these plants.

Nueva reacción en cadena de la polimerasa múltiple para el diagnóstico específico de especies implicadas en la candidiasis humana / A new multiplex PCR for species-specific diagnosis of human candidiasis

RESUMEN Introducción. Las candidiasis son un grupo de infecciones oportunistas causadas por levaduras del género Candida. Candida albicans es la especie de mayor prevalencia en las infecciones superficiales y profundas. Sin embargo, en la última década, la frecuencia de especies diferentes a C. albicans ha aumentado y, por ende, su relevancia clínica, lo cual exige la utilización de técnicas diagnósticas que permitan su detección y el tratamiento adecuado de los pacientes afectados. Objetivo. Diseñar y optimizar una técnica de reacción en cadena de la polimerasa múltiple (PCR múltiple) considerando parámetros termodinámicos para la detección simultánea de cinco especies de Candida relevantes en la etiología de la candidiasis humana. Materiales y métodos. Para el diseño de los cebadores se consideraron restricciones físicas y termodinámicas que afectan la PCR múltiple, usando el programa Gene Runner y la herramienta Mult-PSOS. Como plantillas se utilizaron la región transcrita interna 2 (ITS2) (AJ249486.1) para C. albicans y la topoisomerasa II (TOPII) para C. parasilopsis (AB049144.1), C. krusei (AB049139.1), C. tropicalis (AB049141.1) y C. guillermondii (AB049145.1), y como moldes, extractos de ADN total obtenidos de cepas ATCC y de aislamientos clínicos de las especies de Candida. Resultados. Se diseñaron diez cebadores para la amplificación simultánea de las especies de Candida. Se obtuvo el siguiente patrón de bandas: C. albicans (206 pb), C. guillermondii (244 pb), C. tropicalis (474 pb), C. parasilopsis (558 pb) y C. krusei (419 pb). Conclusión. El ensayo diseñado de PCR múltiple permitió la amplificación simultánea y eficiente de todos los amplicones correspondientes a las especies estudiadas de Candida, así como su adecuada resolución en gel de agarosa al 1,3 %.

ABSTRACT Introduction: Candidiases is a group of opportunistic infections caused by yeasts belonging to the genus Candida. Candida albicans is the most prevalent species in both superficial and deep infections, however, the clinical importance of non-albicans Candida has increased during the last decade, driving an urgent need for diagnostic tests that allow for species-level resolution and selection of the optimum therapeutic approach. Objective: To design and to optimize a new multiplex PCR assay for the simultaneous identification of the five most relevant species of Candida involved in human candidiasis etiology. Materials and methods: For primers design, the physical and thermodynamic restrictions that affect multiplex PCR performance were analyzed using Gene Runner and Mult-PSOS. As templates, the internal transcribed region 2 (ITR2) was selected for C. albicans (AJ249486.1), and topoisomerase II (TOPII) for C. parasilopsis (AB049144.1), C. krusei (AB049139.1), C. tropicalis (AB049141.1), and C. guillermondii (AB049145.1). We used ATCC strains of all these five species and clinical isolates as templates. Results: We designed ten oligonucleotides for the simultaneous amplification of the Candida species. The electrophoresis band profile was: C. albicans (206 bp), C. guillermondii (244 bp), C. tropicalis (474 bp), C. parasilopsis (558 bp), and C. krusei (419 bp). Conclusion: The new multiplex PCR assay designed in this study allowed a simultaneous and efficient amplification of the amplicons corresponding to the five species of Candida under study, with an adequate resolution in standard agarose gel.